Rhodobacter sphaeroides O.U. 001 ile Hidrojen Üretimi

ÖZET

Fotosentetik bakteri R. sphaeroides O.U. 001 argon atmosferi altında ışığa maruz bırakıldığında organik maddelerden hidrojen üretebilmektedir. Bu bakteriyle hidrojen üretiminin incelenmesi ve veriminin arttırılarak maliyetinin düşürülmesine yönelik araştırmalarımız 10 yıldan beri sürdürülmektedir. Bu çalışmalar için özgün bir cam kolon fotobiyoreaktör kurulmuştur. Hidrojen üretimini etkileyen sıcaklık, pH ve ışık yoğunluğu gibi dış faktörler için en uygun değerler belirlenmiştir. Hidrojen üretimi için en uygun başlangıç substrat derişimleri bulunmuş ve substrat tüketim ve hidrojen üretim hızlarını substrat derişimleriyle ilişkilendiren kinetik ifadeler önerilmiştir. Sıvı bakteri ortamına düzenli aralıklarla taze besiyeri ve/veya aktif bakteri kültürü eklenmesi yoluyla sürekli hidrojen çıkışının sağlandığı deneyler gerçekleştirilmiştir. Substrat maliyetini azaltmaya yönelik olarak substratların bir bölümünün şeker fabrikası ya da süt fabrikası atıklarıyla karşılandığı hidrojen üretim deneyleri gerçekleştirilmiş ve standart besiyeriyle belirli oranlarda karıştırılan atıksuda saf besiyeriyle gerçekleştirilenle hemen hemen aynı oranda hidrojen üretilebildiği saptanmıştır. Biyolojik hidrojen üretiminin ekonomik uygunluğunu arttırmaya yönelik bir diğer adım olarak hidrojen üretimi esnasında sentezlenen ve ekonomik değere sahip yan ürünler taranmış ve biyolojik bir plastik olan polihidroksibütirat saptanarak yalıtılmıştır. Hidrojen üretiminin, bakterinin temel hidrojen metabolizması ve hidrojen üretimini tetikleyen enzim sistemi gibi mikro özelliklerinin anlaşılmasına yönelik çalışmalar sürmektedir.

 Anahtar kelimeler: Hidrojen, Fotobiyoreaktör, Rhodobacter sphaeroides, Atıksu, Polihidroksibütirat

 ABSTRACT

The photosynthetic bacterium R. sphaeroides is able to produce molecular hydrogen from organic compounds when grown under an argon atmosphere with illumination. Our studies on the investigation of hydrogen production by this microorganism have been on-going for about a decade. A novel glass column photobioreactor was constructed and the optimum values of external parameters such as temperature, pH and light intensity were found with respect to hydrogen production. The utilisation of the substrates by the bacteria were investigated. From the obtained data, the optimum initial substrate concentrations for hydrogen production were found and kinetic relations relating substrate consumption and hydrogen production rates with substrate concentrations were proposed. Continuous hydrogen production experiments were conducted by addition of fresh nutrient medium and/or active bacterial culture to the hydrogen production medium. In subsequent studies, the possibility of replacing part or all of the substrate with wastewater to reduce the cost was investigated, and wastewater from a sugar refinery and a dairy plant were utilised for this purpose. The results showed that a blend of wastewater with the standard medium produced almost as much hydrogen as produced from the pure standard medium. As a second step to increase the feasibility of biological hydrogen production, by-products of economic value were investigate. The biodegradable polymer polyhydroxybutyrate was detected and isolated.  Studies to understand the microproperties affecting hydrogen production, such as the enzyme systems involved in hydrogen production and the basic hydrogen metabolism of the bacteria are in progress.

Keywords: Hydrogen, Photobioreactor, Rhodobacter  sphaeroides, Wastewater, Polyhydroxybutyrate

1. GİRİŞ

Günümüzde, tükenmekte olan fosil yakıtların yerini alabilecek temiz, yüksek verimli ve yenilenebilir enerji kaynaklarının belirlenerek kullanılabilir duruma getirilmesi uzun vadeli bir gereklilik olmaktan çıkmış ve acil bir ihtiyaç halini almıştır. Önerilen çeşitli alternatifler arasında hidrojen, fosil yakıtlara dayalı teknolojiye nispeten kolayca uyum sağlayabilecek işlevselliğe sahip bir enerji taşıyıcısı olarak göze çarpmaktadır. Bunun yanısıra, tek yanma ürününün su olması, birim kütle başına yüksek enerji içermesi ve yakıt pilleri aracılığıyla doğrudan elektrik enerjisine çevrilebilmesi, hidrojeni geleceğin ideal yakıtı haline getirmektedir.

Hidrojenin bir yakıt olarak kullanımının yaygınlaşması için öncelikle hidrojen üretiminin büyük ölçeklerde  ve doğaya zarar vermeden gerçekleşebilmesi gerekmektedir. Günümüzde endüstriyel ölçekte hidrojen üretiminin tamamına yakını hafif hidrokarbonların parçalanmasıyla gerçekleşmektedir. Hem hammadde hem de enerji kaynağı olarak büyük miktarlarda fosil yakıt tüketilerek gerçekleştirilen bu üretim şekliyle hidrojenin yenilenebilir bir enerji kaynağı olamayacağı ortadadır. Alternatif üretim yollarının geliştirilmesi gerekmektedir.

Doğada anaerobik bakteriler, fotosentetik bakteriler ve alglerin birçok türü metabolizmalarının gereği olarak hidrojen üretebilmektedir. Biyolojik hidrojen üretimi yenilenebilir kaynaklarla ve ılımlı koşullar altında gerçekleşmekte, ayrıca  kullanılan hammaddeler ve oluşan tüm ürün ve yan ürünler biyolojik çevrimin bir parçası olduğundan üretim süreci doğaya zarar vermemektedir. Biyolojik sistemlerle hidrojen üretimi düşük verim ve yüksek maliyet nedeniyle henüz ekonomik olarak uygun olmamakla beraber, yukarıda sözü edilen avantajlar göz önüne alındığında bu üretim biçiminin geliştirilmesine yönelik araştırma faaliyetlerinin sürdürülmesi gerektiği açıktır.

Orta Doğu Teknik Üniversitesi'nde çeşitli mikroorganizmalarla biyolojik hidrojen üretimine yönelik araştırmalar yaklaşık 10 yıldan beri sürdürülmektedir. Bu makalede, fotosentetik bakteri R. sphaeroides O.U. 001 kullanılarak hidrojen üretimi ile ilgili laboratuvarımızda yapılmış olan çalışmalar özetlenecektir.

2. YÖNTEM

Tüm deneylerde R. sphaeroides O.U. 001 (DSM 5648) bakterisi kullanılmıştır. Hidrojen üretim deneyleri 150 ya da 400 mL hacimli özgün su ceketli cam kolon fotobiyoreaktörlerde gerçekleştirilmiştir (1,2). Bakteri üremesi için kullanılan besiyeri, Biebl ve Pfennig (3) tarafından önerilen standart besiyerinin malat ve glutamat  için uyarlanmış halidir. Bazı çalışmalarda hidrojen üretiminde malat ve glutamat yerine veya birlikte A.O.Ç. Süt Fabrikası veya Ankara Şeker Fabrikası atıksuyu kullanılmıştır (4,5).Üretilen gazın kompozisyonu gaz kromatografisiyle belirlenmiş, sıvı ortamın substrat analizi HPLC ile yapılmıştır. Numunelerde pH değeri standart kombine pH elektroduyla ölçülmüş, bakteri derişimi spektrofotometrik yöntemle saptanmıştır. PHB üretimi, 50 mL'lik erlenlerde ve anaerobik kavanozlarda yapılmıştır (6).

3. SONUÇLAR VE ÖNERİLER

Hidrojen üretebilen birçok mikroorganizma arasında fotosentetik bakteriler, güneş ışığının büyük bir bölümünü kullanabilmeleri, yüksek ışık şiddetine dayanabilmeleri ve anaerobik, ışıklı ortamda organik besinlerden yüksek miktarlarda hidrojen üretebilmeleriyle öne çıkmaktadır. Çeşitli fotosentetik bakteri türü arasında da mor-kükürtsüz fotosentetik bakteri R.sphaeroides' in, yüksek hidrojen üretim etkinliğine sahip olduğu görülmüş (7) ve bu bakterinin hidrojen üretiminin araştırılmasına karar verilmiştir. Yapılan ilk çalışmada (1) bakterinin üreme ve hidrojen gazı üretme özellikleri incelenmiştir. Tasarlanıp imal edilen 150 mL hacimli su ceketli bir cam kolon fotobiyoreaktörde yüksek saflıkta ve azami 0.047 L_gaz/s.L_kültür hızına kadar ulaşabilen gaz üretimi gerçekleştirilmiştir. Bunun yanısıra, sıcaklık, değişik ışık kaynakları ve başlangıç pH değeri gibi çeşitli parametrelerin hidrojen üretimine etkisi incelenmiştir. Çalışmada elde edilen bazı sonuçların bir özeti Tablo 1'de verilmiştir. Elde edilen veriler ışığında hidrojen üretimi için en uygun sıcaklık, pH ve ışık yoğunluğu değerleri belirlenmiş ve daha sonraki çalışmalarda da bu değerler kullanılmıştır.

Tablo 1. R. sphaeroides O.U. 001 ile fotobiyolojik hidrojen üretimini etkileyen faktörler

Bir sonraki çalışmanın amacı (2,8) özellikle bakterinin temel karbon ve azot kaynaklarını (malat ve glutamat) ne şekilde kullandığının, ve bu kaynakların başlangıç derişimlerinin hidrojen üretimini ne yönde etkilediğinin nitel ve nicel olarak belirlenmesine odaklanmıştır. Bu çalışmada öncekinden farklı olarak 400 mL hacimli bir fotobiyoreaktör kullanılmış ve hidrojen üretimi esnasında substrat (malat ve glutamat) derişimlerinin izlenmesi için sıvı ortamın HPLC ile analizi yapılmıştır (Şekil 1).

Şekil 1. Başlangıçta 30 mM malat ve 2 mM glutamat içeren besiyeri kullanıldığında  kültürde kalan substrat  yüzdesinin zamana göre değişimi

 Yine bu çalışmada ilk kez sürekli besiyeri ve bakteri eklenmesiyle, kesiksiz hidrojen üretim deneyleri gerçekleştirilmiştir. Elde edilen veriler incelendiğinde hidrojen üretim sürecinin, bakteri üremesi ve hidrojen üretimi evreleri olmak üzere ikiye ayrıldığı görülmüş, karbon-azot oranının biyohidrojen üretiminde önemli bir parametre olduğu belirlenmiştir. Ayrıca yüksek glutamat derişimlerinin hidrojen üretimini engellediği gözlenmiş ve buna bağlı olarak hidrojen üretimi için en uygun malat/glutamat oranının, 0.012 L_gaz/s.L_kültür ile en yüksek hidrojen üretim hızının gerçekleştiği 15 mM/2mM olduğu saptanmıştır (Şekil 2).

Şekil 2. Başlangıçta 15 mM malat ve 3 değişik glutamat derişimi (1,2 ve 10 mM) içeren besiyeri kullanıldığında üretilen toplam hidrojen gazının zamana göre değişimi

 Buna ek olarak, substrat derişimlerinin zamana bağlı değişimleri incelenerek malat tüketim hızı için malat derişimine göre birinci dereceden, glutamat tüketim hızı içinse glutamat derişimine göre ikinci dereceden hız denklemleri önerilmiştir (8).

 Ayrıca, kesikli deneyler için maksimum hidrojen üretim hızıyla substrat derişimlerini ilişkilendiren bir kinetik model önerilmiştir. Kesiksiz hidrojen deneylerinde önce sadece  taze besiyerinin düzenli aralıklarla eklendiği deneyler yapılmış, bu deneylerde 21 güne kadar varan sürekli hidrojen üretimi gerçekleştirilebilmiştir. Bir sonraki aşamada, fotobiyoreaktöre düzenli aralıklarla taze besiyerinin yanısıra aktif bakteri kültürü eklenmiş, bu şekilde yapılan deneylerde ise hidrojen üretimi 70 gün kadar sürmüş ve toplam 3.6 litre gaz üretimi gerçekleşmiştir (Şekil 3). Kesiksiz deneylerin sonunda, sürekli işletim için gerekli seyreltme hızının, kesikli deneylerden elde edilen hidrojen üretim evresindeki bakteri üreme hızına eşit olması gerektiği sonucuna varılmıştır. 

Şekil 3. Sürekli hidrojen üreten sistem her 100 saatte bir 100 ml taze besiyeri ve 30 ml bakteri  ile seyreltildiğinde gerçekleşen hidrojen üretimi

 Çalışmaların önemli bir bölümünde biyolojik hidrojen üretiminin daha önce de belirtildiği gibi yüksek olan maliyetini azaltmaya yönelik araştırmalar yapılmıştır. Substrat maliyetini azaltmak için bakteri besiyerinin bir kısmının veya tamamının atıksulardan oluşturulmasına yönelik iki çalışma yapılmıştır (4,5). Bu çalışmaların ilkinde (5) süt fabrikası atıksuyunun bakterinin üremesine ve hidrojen üretimine etkisi incelenmiştir. Malat yerine sırf atıksu kullanıldığında bakterinin üremediği gözlenmiş, ancak atıksuyun malatla belirli oranlarda karıştırılmasının hem üremeyi engellemediği, hem de sadece malat içeren besiyeriyle karşılaştırıldığında daha fazla hidrojen ürettiği saptanmıştır. Şeker fabrikası atıksuyu ile gerçekleştirilen diğer çalışmada da (4) benzer sonuçlar gözlenmiştir. Bu çalışmada yapılan kesikli deneylerde %5 ila %50 arasında seyreltilmiş atıksuyun  malat ve glutamatla karışımlarının üreme ve hidrojen üretimi üzerindeki etkileri incelenmiştir. %5 ila %30 arasında seyreltilmiş atıksuda bakterinin üreyebildiği gösterilmiş, en yüksek hidrojen üretim hızının ise %20 seyreltilmiş atıksuda elde edildiği belirlenmiştir. Hidrojen üretimini arttırmak için %20 seyreltilmiş şeker fabrikası atıksuyuna, besiyerindeki toplam karbon mol sayısını 15 mM malatın içerdiği karbon-azot  oranını 70/2 yapacak şekilde  malat eklenmiş, bu şekilde gerçekleştirilen deneylerde hidrojen üretim hızının 5 kat arttığı  belirlenmiştir. Karbon kaynağı olarak sadece malat içeren besiyerinin toplam hidrojen üretiminin, malat-atıksu karışımı içeren besiyerinin toplam hidrojen üretimiyle karşılaştırılması Şekil 4'te verilmiştir.

Şekil 4 - R. sphaeroides ile sadece malatla ve malat + %20 şeker fabrikası atıksuyu karışımında  gerçekleşen toplam hidrojen üretimi

 Biyolojik hidrojen üretimini ekonomik kılma yönünde bir diğer adım ise üretim esnasında ekonomik değere sahip yan ürünlerin elde edilebilmesidir. R.. sphaeroides hidrojen üretim koşulları altında polihidroksibütirat üretebilmektedir. Polihidroksibütirat (PHB), ilaç kapsülleri,  sargı bezi, cerrahi iğne, kutu ve paketleme malzemeleri gibi birçok ürünün imalinde kullanılabilen bir hammaddedir ve aynı işlevi görebilecek  diğer malzemelere kıyasla en büyük avantajı  biyolojik olarak bozunabilen ve böylece çevreyi kirletmeyen bir plastik malzeme olmasıdır. R. sphaeroides tarafından üretilen PHB'ın nitel ve nicel analizinin yapılması amacıyla gerçekleştirilen çalışmada (6) bu maddenin hem standart malat/glutamat besiyerinde, hem de malatla birlikte şeker fabrikası atıksuyunun kullanıldığı besiyerinde sentezlenmesi  incelenmiştir. Tablo 2'de değişik besiyerleriyle gerçekleşen üretim deneyler esnasında elde edilen PHB'ın maksimum derişimi ve bakteri hücreleri içindeki kütlece yüzdesi verilmektedir. Şeker fabrikası atıksuyunun malatla beraber kullanıldığı zaman gerçekleşen PHB üretiminin zamana bağlı değişimi Şekil 5'de verilmektedir. Araştırmada ayrıca, PHB üretimiyle hidrojen  üretimi arasındaki ilişkinin belirlenmesine çalışılmıştır. Sonuçlar PHB üretiminin hidrojen üretimiyle paralel bir seyir izlemediğini göstermiştir. PHB üretiminin, hidrojen üretiminden bağımsız olup olmadığı, eğer bağımlı ise hidrojen üretimini engelleyici bir işlem olup olmadığının saptanmasına yönelik çalışmalar devam etmektedir.  

 Tablo 2: Çeşitli besiyerlerinde PHB birikimi

Şekil 5.  % 30  şeker fabrikası atığı içeren besiyeriyle gerçekleştirilen deneyde gözlenen PHB derişiminin zamana bağlı değişimi

 Şu ana kadar R. sphaeroides bakterisinin hidrojen üretimini etkileyen kontrol edilebilir dış faktörler için en uygun değerler saptanmış, hidrojen üretimini substrat derişimleriyle ilişkilendiren kinetik ifadeler önerilmiştir. Ayrıca sürekli hidrojen çıkışı elde edilmesine yönelik deneylere ek olarak şeker ve süt fabrikası atıklarının substrat olarak denendiği çalışmalar yapılmış ve bakterinin hidrojen üretimi esnasında sentezledeği ekonomik değere sahip bir yan ürün olan polihidroksibütiratın belirlenmesi ve yalıtımı gerçekleştirilmiştir. Varılan noktada artık hidrojen üretimini etkilen mikro-faktörler; yani anahatlarıyla bakterinin hidrojen metabolizmasının, hidrojen sentezleyen enzim sisteminin ve bu sistemleri üst seviyede kontrol eden genetik yapısının belirlenmesi gerekmektedir. Devam etmekte olan araştırmalar da buna odaklanmıştır.

Teşekkür: Araştırmalarımız KTÇAG 115, TBAG 1535 , ODTÜ AFP 97-07-02-04 ve AFP 99-06-02-13 projeleriyle desteklenmiştir.

 4. KAYNAKLAR 

1. Arık, T.,  Gündüz, U., Yücel, M., Türker, L., Sediroğlu, V., Eroğlu, İ.,  "Photoproduction of hydrogen by Rhodobacter sphaeroides O.U.001", Proceedings of the 11th World Hydrogen Energy Conference, Stuttgart, Germany, Vol 3, 2417-2424, 1996
2. Eroğlu, İ., Aslan, K., Gündüz, U., Yücel, M., Türker, L., "Continuous hydrogen production by Rhodobacter sphaeroides O.U.001.", O.R. Zaborsky (ed.) Biohydrogen, Plenum Press, New York, 143-150, 1998.
3. Biebl, H., Pfennig N., "Isolation of Member of the Family Rhodosprillaceae" M.P. Starr, H. Stolp, H.G. Trüper, A. Balows, H.G. Schlegel (eds.) The Prokaryotes, Springer-Verlag, New York,  Vol. 1, 267-273, 1981
4. Yetiş, M.,  Gündüz, U., Eroğlu İ., Yücel, M., Türker, L., "Photoproduction of hydrogen from sugar refinery wastewater by Rhodobacter sphaeroides O.U.001", Int. J. Hyd. Eng., 25: 1035-1041, 2000
5. Türkarslan, S., Yiğit, DÖ., Aslan, K., Eroğlu, İ., Gündüz, U., "Photobiological hydrogen production by Rhodobacter sphaeroides O.U.001 by utilization of waste water from milk industry.", O.R. Zaborsky (ed.) Biohydrogen, Plenum Press, New York, 151-156, 1998
6. Yiğit, D.Ö., Gündüz, U., Türker, L., Yücel, M., Eroğlu, İ. "Identification of by-products in hydrogen producing bacteria; Rhodobacter sphaeroides O.U.001 grown in the waste water of a sugar refinery." J. Biotech. 70:125-131, 1999.
7. Kim, J.S., Ito, K., Izaki, K., Takahashi, H., "Production of molecular hydrogen by a semi-continuous outdoor culture of Rhodopseudomonas sphaeroides", Agric. Biol. Chem., 51:1173, 1987
8. Eroğlu, İ., Aslan, K., Gündüz,U., Yücel, M., Türker, L., "Substrate consumption rates for hydrogen production by Rhodobacter sphaeroides in a column photobioreactor", J. Biotech., 70: 103-113, 1999